Abstract

EWS-FLI1 represents a paradigm for cancer associated fusion genes that result in the expression of oncogenic chimeric transcription factors. In the preceding project P14299-B04 we cloned genomic DNA from Ewing´s sarcoma chromatin precipitating with EWS-FLI1 to characterize direct target genes within the authentic cellular context avoiding artificial model systems. We obtained a comprehensive list of 100 putative direct transcription factor targets identified, for the first time, by a hypothesis-free approach based on physical interaction only. One third of genes recovered showed a significant Ewing´s sarcoma specific expression pattern and were found to be altered upon RNA interference mediated knock-down of EWS-FLI1. So far, only one gene from the list, MK-STYX, has been further validated as a directly EWS-FLI1 regulated gene by in-vitro delineation of the EWS-FLI1 binding site, reporter gene assays, and demonstration of consistent expression in primary Ewing´s sarcoma. The current project aims at the confirmation of further candidate EWS-FLI1 regulated genes from the existing list and in extension of this list using the strategies and optimized procedures established during the previous project. Delineation of individual EWS-FLI1 binding sites within the confirmed target genes will likely lead to the definition of the architecture of a bona fide EWS-FLI1 responsive element. In addition, the role of MK-STYX activation by EWS-FLI1 for Ewing´s sarcoma biology shall be investigated. By comparing the molecular signatures (as assessed by Affymetrix GeneChip analysis) of confirmed target genes with that of EWS-FLI1 after modulating the expression through either forced expression or RNAi mediated knock-down we will be able to define a hierarchy of genes downstream of the oncogenic transcription factor.

Zusammenfassung

EWS-FLI1 stellt ein Musterbeispiel für ein Krebs-assoziiertes Fusionsgen dar, welches in der Expression eines chimären onkogenen Transkriptionsfaktors mündet. Im vorangegangenen Projekt P14299-B04 klonierten wir genomische DNA aus dem Chromatin von Ewing´s Sarkomzellen, welche mit EWS-FLI1 ausgefällt werden konnte. So wurden direkte Zielgene im authentischen zellulären Hintergrund unter Vermeidung von artifiziellen Modellsystemen charakterisiert. Mit dieser hypothesefreien Klonierungsstrategie, welche erstmals auf rein physischen Interaktionen zwischen dem Transkriptionsfaktor und seinen Zielgenen basiert, erhielten wir eine Liste von 100 Genen. Ein Drittel dieser Gene zeigte ein für Ewing´s Sarkome spezifisches Expressionsmuster und war von RNA Interferenz vermittelter Modulation der EWS-FLI1 Expression betroffen. Bisher wurde erst 1 Gen aus dieser Liste, MK-STYX, als ein von EWS-FLI1 direkt reguliertes Gen bestätigt, in dem die EWS-FLI1 Bindungsstelle genau eingegrenzt wurde, die Regulation in Reportergenassays nachgewiesen werden konnte, und eine gleichmäßige Expression in primären Ewing´s Sarkomen nachgewiesen werden konnte. Im vorliegenden Projektantrag wollen wir mit den gleichen Strategien und den im Vorgängerprojekt optimierten Methoden weitere Kandidatengene aus unserer Liste als direkte EWS-FLI1 Zielgene bestätigen, sowie die Liste erweitern. Die Eingrenzung der individuellen EWS-FLI1 Bindungsstellen in so bestätigten Zielgenen sollte eine Definition der spezifischen Architektur eines bona-fide EWS-FLI1 Responselements führen. Zusätzlich soll die Rolle der MK-STYX Aktivierung durch EWS-FLI1 für die Biologie von Ewing´s sarkomen untersucht werden. Indem wir die individuellen molekularen Signaturen (Affymetrix GeneChipanalyse) der Zielgenexpression mit der von EWS-FLI1 vor und nach Modulation durch Verstärkung einerseits und RNA Interferenz-vermittelter Verringerung andererseits vergleichen, wird es uns schließlich möglich sein, eine Hierarchie der Genexpression, an deren Spitze EWS-FLI1 steht , zu definieren.