Final Report

The development and patenting (A 1934/2005) of different molecular techniques based on real-time PCR (RQ-PCR) permitting highly sensitive detection and quantitative analysis of a broad spectrum of human pathogenic fungi can be regarded as the most important achievement of the current project. The Pan-AC RQ-PCR assay facilitates the detection and quantitative assessment of all clinically relevant Aspergillus and Candida species, which are currently responsible for the great majority of invasive fungal infections in humans. The second important test developed in our laboratory, the Pan-fungus RQ-PCR assay, permits rapid and economic detection of more than 80 different fungal species and displays the broadest specificity of all molecular fungus detection assays available to date. This assay covers not only all Aspergillus and Candida species of clinical interest, but also detects virtually all newly emerging fungal species, whose incidence has recently been shown to rise in immunocompromised patients. The new fungus detection assays were employed to investigate prospectively collected peripheral blood specimens primarily from patients who underwent allogeneic stem cell transplantation in our hospital. More than 5.000 tests were performed in serial samples of pediatric patients and revealed the presence of several different, occasionally also rare types of pathogenic fungi. The incidence of invasive fungal infections detected by molecular screening in the cohort of patients investigated was approximately 20%. Species identification by PCR fragment length analysis, a technique established in our laboratory during the course of the project, was initially confirmed by DNA sequencing to assess the reliability of this technical approach. In the final phase of the project, we have tackled the development of an alternative technique for rapid identification of fungal species based on microbead hybridization and flow-cytometric detection. This promising technique is currently in an advanced stage of development and may be amenable to patenting.  Owing to the high specificity, the introduction of this technique as a diagnostic test would be an important step forward in clinical fungus diagnosis.

An important lesson that has emanated from this project was the extremely high risk of contamination of molecular fungus detection assays attributable to the ubiquitous presence of fungal spores and traces of fungal DNA. In order to be able to continue with the investigation of clinical specimens at a high level of safety, it is necessary to extend the laboratory and supply it with additional biohazard equipment. Based on the experience of the present study, we have recently initiated follow-up projects with the intention to further develop the new fungus detection techniques to establish and market validated diagnostic tests in collaboration with an industrial partner. We are convinced that the insights gained from the current study supported by the FWF will be instrumental in our ongoing effort to optimize clinical diagnosis of fungal infections, which can be expected to contribute to improved treatment outcome in immunocompromised patients.

Endbericht

Der wesentliche Erfolg des abgeschlossenen Projektes liegt in der Entwicklung und Patentierung (A 1934/2005) verschiedener molekularer Verfahren auf der Grundlage der real-time PCR, die einen hochsensitiven und quantitativen Nachweis eines breiten Spektrums humanpathogener Pilze ermöglichen. Der Pan-AC RQ-PCR Assay gestattet die Detektion und Quantifizierung aller klinisch relevanten Aspergillus und Candida Arten (Spezies), die derzeit für den Großteil der invasiven Pilzinfektionen bei Menschen verantwortlich sind. Der zweite wichtige, von uns entwickelte Test, der Pan-fungus RQ-PCR Assay, gestattet einen schnellen und ökonomischen Nachweis von mehr als  80 verschiedenen Pilzspezies und hat damit die bei weitem breiteste Spezifität aller bisher verfügbaren, molekularen Pilzdetektionsverfahren.

Dieser Assay deckt nicht nur alle klinisch interessanten Aspergillus und Candida Spezies ab, sondern detektiert auch praktisch alle neu auftretenden Pilzarten, die mit zunehmender Häufigkeit  bei Patienten mit geschwächter Immunabwehr  beobachtet werden.

Die neuen Pilzdetektionsverfahren wurden zur Analyse von prospektiv gesammelten Blutproben eingesetzt, die primär von Patienten stammten, die in unserem Krankenhaus mit einer allogenen Stammzelltransplantation behandelt wurden. Mehr als 5.000 Analysen wurden in seriellen Patientenproben durchgeführt, wobei eine Reihe verschiedener, zum Teil seltener Pilzarten beobachtet wurde. Die Inzidenz von molekular nachgewiesenen, invasiven Pilzinfektionen lag in der untersuchten Patientenpopulation bei 20%. Die Identifizierung einzelner Pilzspezies mit Hilfe der PCR-Fragmentlängenanalyse, einem im Rahmen dieses Projektes etablierten Verfahren,  wurde zunächst mittels DNA-Sequenzierung bestätigt, um die Verlässlichkeit dieser Methodik zu überprüfen. In der Schlussphase des Projektes haben wir mit der Entwicklung einer alternativen Methode zur raschen Identifizierung von Pilzspezies begonnen, die auf einer Microbead-Hybridisierung mit durchflusszytometrischer Detektion beruht. Dieses viel versprechende und möglicherweise patentierbare Verfahren, das sich derzeit in einem fortgeschrittenen Stadium der Entwicklung befindet, wäre vor allem dank seiner hohen Spezifität ein wichtiger Fortschritt in der klinischen Pilzdiagnostik.

Die aus diesem Projekt resultierenden, wichtigen Beobachtungen haben uns die extrem hohe Kontaminationsgefahr der molekularen Pilzassays vor Augen geführt, die auf das ubiquitäre Vorkommen von Pilzsporen und Spuren von Pilz-DNA zurückzuführen ist. Um mit den Analysen klinischer Proben auf einem hohen Sicherheitsniveau fortfahren zu können, ist ein Ausbau des Labors und eine zusätzliche Biohazard-Austattung erforderlich. Im Rahmen von rezent initiierten Nachfolgeprojekten, die auf den wichtigen Erkenntnissen aus dem abgeschlossenen FWF-Projekt aufbauen, sollen die neuen Detektionsverfahren in Kooperation mit einem Industriepartner bis zur Marktreife weiter entwickelt werden.

Wir sind überzeugt, dass die im Rahmen dieser vom FWF geförderten Studie gewonnenen Erkenntnisse einen wichtigen Beitrag zur Optimierung der klinischen Pilzdiagnostik bei immunsupprimierten Patienten und damit zu einer Verbesserung des Therapieerfolges leisten werden.