Abstract

Invasive fungal infections (IFI) have become a major cause of morbidity and mortality in immunocompromised patients undergoing intensive chemotherapy for hematological malignancies or bone marrow transplantation. The incidence of IFI in febrile patients with therapy-induced neutropenia has been estimated at 10-20%, leading to a mortality rate of up to 80%. The vast majority of IFI are caused by Candida and Aspergillus species, but recent epidemiological studies from North America indicate the emergence and increasing incidence of previously uncommon fungal species such as hyaline moulds, dematiaceous filamentous fungi and yeast-like pathogens. Reports on the occurrence of the emerging fungi from European centers are scarce, suggesting either lower frequency or underdiagnosis of these pathogens.

Current diagnostics of IFI is based on microbiological, histopathological and radiological findings. These techniques, however, are often not sensitive or fast enough to permit rational and timely initiation of treatment. In the clinical setting, the onset of antimycotic treatment is therefore generally based on indirect evidence for systemic fungal infections: clinical signs of sepsis unresponsive to different antibacterial agents for greater than 72-96 hours. This strategy, however, may lead to significant, and possibly deleterious delay of antimycotic therapy in patients with fungal sepsis. On the other hand, the pronounced organ toxicity of some antimycotic drugs provides a strong argument against prophylactic application of antifungal agents. Initiation of systemic antimycotic treatment based merely on clinical suspicion results in an unnecessary increase of organ toxicity in instances in which no IFI is present. It is of great interest therefore to establish ways of managing antimycotic treatment in immunocompromised patients based on firm evidence. To address this task, it is necessary to develop diagnostic approaches permitting rapid detection of invasive fungal infections. This would allow timely initiation of treatment, which is crucial for successful therapy.

As a prerequisite for addressing the tasks of the proposed study, a DNA-based quantitative pan-fungal detection assay based on the real-time Q-PCR technology will be established. This test will be designed to permit detection and quantitative analysis of all clinically relevant fungal species in a single reaction. The spectrum of human pathogenic fungi to be covered by this assay includes all important Aspergillus and Candida species, as well as other yeasts and moulds of potential clinical relevance, such as Trichosporon, Fusarium, Mucor or Rhizopus species as well as Cryptococcus neoformans, Saccharomyces cerevisiae and Malassezia furfur. The conceptual design of the pan-fungal RQ-PCR assay should significantly extend the capacity of currently existing real-time PCR approaches by facilitating the detection of close to 20 pathogenic fungal species in one test.

Upon establishment of the necessary diagnostic tool, a multi-center study in pediatric patients undergoing intensive chemotherapy for malignant hematological disorders, selected solid tumors or bone marrow transplantation will be carried out. In this cohort of patients, the following hypotheses will be tested:

• Pan-fungal RQ-PCR screening in peripheral blood samples of children during early stages of chemotherapy reveals asymptomatic fungemia in a proportion of individuals. These patients carry a particularly high risk of developing IFI during aplasia.
• Molecular detection and quantification of fungal pathogens in peripheral blood permits early diagnosis of IFI in patients with febrile neutropenia.
• The lack of molecular detection of fungal pathogens in peripheral blood correlates with absence of IFI.

It is conceivable that molecular screening in children receiving anti-tumor therapy will permit early identification of patients who have a high risk of IFI and might therefore benefit from preemptive antifungal treatment. Moreover, the results of the study are expected to provide a basis for rational antifungal therapy, permitting early initiation of treatment in patients with IFI, and avoiding unnecessary treatment-associated toxicity in patients who do not require systemic antifungal therapy.

Zusammenfassung

Invasive Pilzinfektionen (IPI) gehen bei immungeschwächten Patienten unter intensiver Chemotherapie im Rahmen maligner Erkrankungen oder vor einer Knochenmarktransplantation (KMT) mit einer hohen Morbidität und Mortalität einher. Die Inzidenz von IPI bei febrilen Patienten mit therapieinduzierter Neutropenie wird auf 10-20% geschätzt und die Mortalitätsrate beträgt in solchen Fällen bis zu 80%. Der' Großteil invasiver Pilzinfektionen wird durch verschiedene Candida und Aspergillus Stämme verursacht. Allerdings zeigen neue epidemiologische Studien aus Nordamerika ein zunehmendes Auftreten von bisher selten beobachteten Pilzarten, wie etwa hyalinen Schimmelpilzen, chromogenen Fadenpilzen, und Hefeähnlichen Pathogenen. Von Europäischen Zentren gibt es nur vereinzelt Berichte über das Vorkommen dieser Pilzarten. Dies könnte entweder auf ein weniger häufiges Vorkommen oder auf unzureichende Diagnose dieser Pathogene zurückzuführen sein.
Die derzeitige Diagnostik einer IPI beruht auf mikrobiologischen, histopathologischen, und radiologischen Untersuchungen. Diese Verfahren sind allerdings oftmals nicht sensitiv oder schnell genug, um eine rationale und zeitgerechte Behandlung zu ermöglichen In den meisten klinischen Situationen beruht daher der Einsatz antimykotischer Therapie nur auf indirekten Hinweisen auf das Vorliegen einer systemischen Pilzinfektion, zumeist klinischen Zeichen einer Sepsis, die mehr als 72-96 Stunden auf diverse antibakterielle Therapiemaßnahmen nicht anspricht. Diese Vorgangsweise kann aber bei Vorliegen einer Pilzsepsis zu einer eventuell folgenschweren Verzögerung des Einsatzes antimykotischer Therapie führen Andererseits spricht jedoch die ausgeprägte Organtoxizität mancher antimykotischen Substanzen gegen deren prophylaktische Verabreichung. Der Einsatz systemischer Pilztherapie, der nur auf der Grundlage eines klinischen Verdachts beruht, führt in Fallen, in denen keine IPI vorliegt, zu einer unnötigen Erhöhung der Organtoxizität. Es wäre daher bei immunsupprimierten Patienten von großer Wichtigkeit, ein Management der antimykotischen Therapie zu erarbeiten, das auf verlässlichen diagnostischen Daten beruht. Um dieses Ziel zu erreichen, müssen Verfahren für einen schnellen Nachweis invasiver Pilzinfektionen entwickelt werden. Diese würden einen frühzeitigen Therapiebeginn ermöglichen der eine wesentliche Voraussetzung für den Behandlungserfolg darstellt.
Um die Fragestellungen der vorliegenden Studie bearbeiten zu können ist die Etablierung eines quantitativen DNA-Detektionsverfahrens für pathogene Pilze unter Verwendung der
real-time Q-PCR Technologie geplant. Die Konzeption dieses ,,Pan-Fungus" Tests sollte den Nachweis und die Quantifizierung aller klinisch relevanten Pilz-Species in einer Reaktion ermöglichen Das Spektrum der humanpathogenen Plize, die von diesem Assay abgedeckt werden sollen, beinhaltet alle wichtigen Aspergillus- und Candida-Stämme sowie andere Hefe- und Schimmelpilze von möglicher klinischer Relevanz. Zu diesen gehören unter anderem Trichosporon-, Fusarium-, Mucor- und Rhizopus-Stämme sowie Cryptococcus neoformans, Saccharomyces cerevisiae und Malassezia furfur. Das konzeptuelle Design des geplanten Pan-Fungus RQ-PCR Verfahrens sollte den Nachweis von etwa 20 pathogenen Pilzen in einem Test ermöglichen Die breite Spezifität des Assays würde über die Kapazität der derzeit verfügbaren real-time PCR Methoden deutlich hinausgehen.
Nach Etablierung der erforderlichen diagnostischen Verfahren, wird eine multizentrische Studie bei pädiatrischena Patienten unter intensiver Chemotherapie von malignen hämatologischen Erkrankungen, ausgewählten soliden Tumoren sowie nach allogener KMT durchgeführt. Im Rahmen der Studie werden folgende Hypothesen geprüft:

1. Bei einem Teil der pädiatrischena Patienten kommt es während der frühen Phase der Chemotherapie zu einer asymptomatischen Fungamie, die mit Hilfe des Screenings mittels Pan-Fungus-PCR detektierbar ist. Diese Patienten haben ein besonders hohes Risiko, in Phasen der Aplasie an einer IPI zu erkranken.
2. Molekularer Nachweis und Quantifizierung pathogener Pilze im peripheren Blut ermöglichen bei Patienten mit febriler Neutropenie die frühzeitige Diagnose einer invasiven Pilzinfektion.
3. Negative molekulare Befunde für Pilzpathogene im peripheren Blut stellen ein Ausschlusskriterium für das Vorliegen einer IPI dar.

Die Studie wird zeigen, ob ein Pilzpathogen-Screening mit molekularen Methoden bei Kindern unter Chemotherapie die Früherkennung von jenen Patienten ermöglicht die ein hohes Risiko für eine IPI haben und die daher von einer präemptiven Pilztherapie profitieren würden Darüber hinaus erwarten wir, dass die Ergebnisse dieser Studie Grundlagen für eine rationale Therapie invasiver Pilzinfektionen liefern werden. Die quantitative RQ-PCR Diagnostik soll einerseits eine frühzeitige Behandlung von Patienten mit einer IPI ermöglichen und andererseits, in Fällen, in denen keine systemische Pilztherapie indiziert ist, eine zusätzliche therapiebedingte Toxizität verhindern.