Final Report

Dissection of the EWS-FLI1 oncogenic pathway by RNA interference

Ewing´s sarcoma is the second most frequent malignant bone tumor in children and young adults. It is characterized by a unique chromosomal rearrangement that leads to the fusion of two unrelated genes, EWS and FLI1, to form a chimeric gene with novel properties (EWS-FLI1). The presence of this chromosome aberration is always accompanied by high levels of a protein of unknown function, CD99, on the surface of the tumor cells, suggesting a functional link between these two diagnostic features of the disease. The tissue of origin for Ewing´s sarcoma is not known. When introduced into normal primary human cell types, EWS-FLI1 kills the cells by a mechanism involving a master regulatory protein of cell fate regulation, p53. Paradoxically, p53 is retained in more than 90% of Ewing´s sarcomas suggesting the presence of a protection mechanism that renders the tumor cells tolerant to EWS-FLI1. Therefore, the most relevant model for studying the oncogenic properties of the fusion gene remains the Ewing´s sarcoma cell itself.

To assess the importance of the presence of EWS-FLI1 for sustained tumor cell growth, we chose to suppress its expression in 6 Ewing´s sarcoma cell lines exploiting an evolutionary conserved mechanism of gene regulation by small gene-specific double stranded RNAs, called RNA interference (RNAi). By comparing the profiles of overall gene expression in the presence and absence of EWS-FLI1 we assessed the molecular consequences of the chromosomal rearrangement for the tumor cells. In addition, we adopted a method, chromatin immunoprecipitation (ChIP), which enabled us to isolate genes directly bound by EWS-FLI1 within the tumor cells, in order to identify candidate mediators of its oncogenic function.

Using a combination of these approaches we identified and studied in great detail a new mechanism by which EWS-FLI1 keeps p53 in check to allow for sustained Ewing´s sarcoma cell proliferation. It relies on the suppression of an important pathway in normal development and tissue formation, the NOTCH signalling pathway. Our results suggest that the enigmatic cell of origin for Ewing´s sarcoma is a resting cell with elevated basal p53 expression and active NOTCH signalling. Further, we identified 99 genes which appeared to be directly regulated by EWS-FLI1. The regulation of one of these genes, MK-STYX, was characterized in detail. In addition, we found that, although influenced by EWS-FLI1, high CD99 expression is a feature of Ewing´s sarcoma independently required for the pathogenesis of the disease. Down-regulation of CD99 resulted in a loss of the migratory and tumor forming ability of the tumor cells. Applying RNAi to CD99 we were able to identify a gene downstream of this protein and involved in its migration regulatory function. Thus, our study resulted in important new findings about the characteristics of the tissue of origin, the mechanism of growth regulation and metastasis in Ewing´s sarcoma.

Endbericht

Analyse des EWS-FLI1 onkogenen Pathways mttels RNA Interferenz

Das Ewing´s Sarkom ist der zweithäufigste Knochentumor des Kindes- und Jugendalters. Es ist durch eine Chromosomenumlagerung gekennzeichnet, die zur Fusion zweier unverwandter Gene führt, EWS und FLI1, wodurch ein chimäres Gen mit völlig neuen Eigenschaften entsteht (EWS-FLI1). Ist die spezifische Chromosomenumlagerung vorhanden, so findet sich an der Oberfläche der Tumorzellen auch immer ein Protein mit bisher weitgehend unbekannter Funktion, CD99. Dieser Befund weist auf eine funktionelle Abhängigkeit der beiden molekularen Charakteristika, die einen besonderen diagnostischen Stellenwert für Ewing´s Sarkome genießen, hin. Das Ursprungsgewebe für das Ewing´s Sarkom ist unbekannt. Führt man EWS-FLI1 in normale menschliche Zellen ein, so aktiviert es ein zentrales Überwachungsgen, p53, das zum Wachstumsstopp oder sogar Tod der Zellen führt. Paradoxer Weise tolerieren mehr als 90% aller Ewing´s Sarkome die Anwesenheit von p53, was auf das Vorhandensein eines Schutzmechanismus vor der toxischen Wirkung von EWS-FLI1 in den Tumorzellen hinweist. Deshalb ist das relevanteste Modell zum Studium der onkogenen Funktion des chimären Gens die Ewing´s Sarkomzelle selbst.

Um die Bedeutung von EWS-FLI1 für das fortgesetzte Wachstum von Ewing´s Sarkomen zu studieren, haben wir uns entschieden, seine Expression in 6  Ewing´s Sarkomzelllinien unter Nutzung eines evolutionär konservierten Mechanismus der RNA-vermittelten Genrepression zu unterdrücken. Dieser Mechanismus wird RNA Interferenz (RNAi) genannt und basiert auf der Einführung von kleinen, doppelsträngigen, genspezifischen RNA Molekülen. Durch Vergleich des generellen Genexpressionsmusters in An- und Abwesenheit von EWS-FLI1 studierten  wir die funktionelle Bedeutung der Genfusion für die Tumorzellen. Außerdem adaptierten wir die Methode der Chromatin Immunpräzipitation, um uns in die Lage zu versetzen, in Tumorzellen direkt EWS-FLI1-gebundene Gene zu isolieren, um damit Mediatoren der onkogenen Wirkung des Fusionsgenproduktes zu identifizieren.

Durch eine Kombination dieser Methoden war es uns möglich, einen völlig neuen Mechanismus der p53 Kontrolle in Ewing´s Sarkomzellen zu entdecken und im Detail zu studieren. Unsere Resultate zeigten, dass EWS-FLI1 durch Unterdrückung eines in der normalen Gewebsentwicklung wichtigen Mechanismus, des NOTCH Signalübertragungsweges, die p53 Aktivierung und damit einen Wachstumsstopp verhindert. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass der Ursprungszelltyp des Ewing´s Sarkoms wahrscheinlich eine ruhende Zelle mit aktivem NOTCH Signalweg und erhöhtem p53 Basalspiegel ist. Wir identifizierten weiters 99 direkt von EWS-FLI1 regulierte Gene, wovon für eines, MK-STYX, der Regulationsmechanismus im Detail charakterisiert wurde. Außerdem fanden wir, dass obwohl die CD99 Expression von EWS-FLI1 beeinflusst wird, hohe Expression dieses Proteins eine für die Krankheitsentwicklung unabhängig notwendige Eigenschaft ist. Unterdrückung der CD99 Bildung führte zum Verlust der Tumorbildung im Mausmodel und der für die Metastasierung notwendigen Wanderungsfähigkeit der Tumorzellen. Es gelang uns über einen RNAi-Ansatz ein wichtiges von CD99 unterdrücktes Gen zu identifizieren, KCMF1, welches für die regulatorische Funktion von CD99 für die Tumorzellmigration mitverantwortlich ist.

So konnten durch unsere Studie wichtige neue Erkenntnisse über die Eigenschaft der Urprungszelle, und die Mechanismen der Wachstumsregulation und Metastasierung von Ewing´s Sarkomen gewonnen werden.